利血平结晶工艺的研究

药物生物技术Pharmaceutical Biotechnology 2007, 14(2): 110-114利血平结晶工艺的研究孙蕾,冯蕾,周叶,钱秀萍,赵凤生(上海交通大学药学院,上海200240)摘要研究从催吐萝芙木中提取利血平的结晶工艺。催吐萝芙木根粉经粗提沉淀生物碱溶解沉淀沉淀胶质粗结晶、重结晶制得利血平。通过单因素法实验,对可能影响利血平提取的因素进行了考察。确定了适宜的利血平结晶工艺。得到的利血平纯度达984%提取总收率298%。本结晶工艺所得利血平的纯度和收率均较高适宜于工业生产。关键词催吐萝芙木;利血平;结晶中图分类号:R284.2文献标识码:A文章编号:1005-8915(2007)02011005萝芙木为夹竹桃科植物萝芙木[ Rauvol/ia学试剂有限公司),工业乙醇(上海振兴化工verticilata(lour) BailL.]的根和茎。萝芙木含厂),其他试剂为分析纯(国药集团化学试剂有限有利血平( reserpine)、育享宾利血胺、坎尼生等多公司),H2-818大孔吸附树脂(华东理工大学华种吲哚类生物碱,是云南省南药的重要组成部震科技有限公司)。分2。利血平具有显著的降压镇静和安定作用是一种常用的降压药。目前利血平的提取是用2方法苯为溶剂,经与强碱性生物碱初步分离后,使利血平转化为硫氰酸盐得以纯化。该工艺有机溶剂用2.1高压液相色谱测定利血平的条件量大,利血平转化为硫氰酸盐的得率较低,包夹有色谱柱: ZORBAX SBO18(4.6mm×250mm,较多脂溶性杂质,不易纯化3。5μm);流动相:甲醇-H2O-三乙胺(72:28:云南思茅伟农植物制药有限公司从非洲引种0:01);:流速:1.0ml/min;检测波长:267m;柱的催吐萝芙木( Ranvol fia vomitoria),利血平含量温:30℃为云南萝芙木的2~3倍。本课题组采用催吐萝芙2.2催吐萝芙木根粉中利血平含量的测定木为原料,用酸醇提取法取代苯提取法,再经HZ称取干燥的催吐萝芙木根粉10g,置于500ml818大孔吸附树脂纯化,得到利血平的粗提物。进锥形瓶中,用10ml水润湿后,加入100m含50%步探讨了利血平的结晶工艺,建立了一条有机溶工业乙醇的0.025mo/LH2SO2溶液在避光的条剂用量少、对环境污染小、结晶纯度高的提取利血件下放入摇床中振荡温度20℃,转速250r/min。平的新工艺。将催吐萝芙木根粉滤出,加入100m含50%工业1仪器与材料乙醇的0.025mol/LH2SO溶液再浸提1次。每Agilent100srs高压液相色谱仪及工作次浸提时间均为2h合并2次浸提液并取样检站(德国安捷伦公司)。测,计算催吐萝芙木中利血平含量Φ35mm×400mm玻璃层析柱。2.3利血平粗提液的制备干燥的催吐萝芙木根粉(云南思茅伟农植物取干燥的催吐萝芙木根粉2500g,用2500ml水制药有限公司提供),利血平对照品(Sgma公润湿加个含5%T业了酸的a25m/LHSO溶司),高压液相色谱用甲醇(色谱纯国药集团化液浸中国煤化工次浸提时间均为CNMHG收稿日期:2006-11-10修回日期:2006-12作者简介:孙蕾,1983年生,女,汉族,上海市人,硕士研究生,研究方向:天然药物提取与分离通讯联系人:赵风生Te:021-34204528,E-mail1Rizhao@sjtu.edu.cn孙蕾等:利血平结晶工艺的研究1114h,浸提液体积分别为25,12.5L。将两份浸提液2.4.4粗结晶分别减压蒸去乙醇,过滤,滤液作为吸附原液。先2.4.4.1溶剂的选择取24ml沉胶后的上清将第二次浸提的吸附原液以13.5ml/min体积流液,分成4等份,蒸干。取2份样品,各加入1ml量通人250mlHZ-818大孔树脂柱进行吸附,再乙酸乙酯溶解,分别浓缩至约100μl,然后分别加以10.6ml/min体积流量通入第一次浸提的吸附6倍乙酸乙酯液体积的甲醇或乙醇;另2份样品原液。然后用500ml去离子水以8.3m/min体各加入1m丙酮溶解,分别浓缩至约100pl,然后积流量通人柱中洗涤。用750ml工业乙醇一水分别加入6倍丙酮液体积的甲醇或乙醇。4份样(80:20,pH1.0)进行解吸,平均体积流量品均混匀后置于4℃冰箱中20h结晶,离心,晶体6.3ml/min。弃去刚开始流出的125ml解吸液,收用氯仿溶解后检测利血平含量。集后面的625ml解吸液,即为利血平粗提液,用作2.4.4.2甲醇用量的选择取50ml沉胶后的上结晶工艺研究。清液,分成4等份,蒸干后,分别加250dl乙酸乙2.4利血平的结晶工艺酯溶解后加入不同量的甲醇,4℃放置20h,离2.4.1沉淀生物碱得到利血平粗提液后,蒸去心,得粗结晶。晶体用氯仿溶解后检测利血平粗提液中的大部分乙醇,再加入一部分水,以减少含量利血平的溶解度,然后调节pH到碱性,使包括利2.4.5重结晶取粗结晶250mg,加过量丙酮溶血平在内的生物碱沉淀,再进一步纯化解后,分成3等分,分别浓缩至2ml,分别加入不同2.4.1.1加水量的选择取5份利血平粗提液,体积的甲醇,4℃放置20h,离心,得结晶。结晶用每份25ml,分别在50℃真空浓缩至约10ml,加入氯仿溶解后检测利血平的含量。不同体积的水,用浓NaOH溶液调pH至8.0,离2.5小试工艺验证沉淀各加20ml丙酮,热水浴中溶解,离心,检取干燥的催吐萝芙木根粉2500g,按照上述测上清中利血平含量;沉淀再各加10ml氯仿溶利血平粗提液的制备方法,浸提得到利血平粗提解离心,检测上清中利血平含量,计算沉淀利血平液。粗提液经减压浓缩至170m,加入340ml水稀的收率。释,调至pH8.5,在4000r/min离心10min,得到2.4.1.2pH值的选择取5份利血平粗提液,生物碱沉淀。用450m丙酮氯仿(9:1)溶液溶每份20ml,分别在50℃真空浓缩至约7ml各加解沉淀离心除去不溶性杂质。上清液减压蒸馏除2倍水,用浓NaOH分别调至pH6.0,7.0,8.0,去有机溶剂,弃去剩余的水相,沉淀加入31ml丙9.0,10.0,离心。沉淀各加20ml丙酮溶解,离心,酮溶解,再加人31ml氯仿一石油醚(1:1)沉淀检测上清中利血平含量。沉淀再各用10ml氯仿胶质。离心得到上清液,蒸干。用2ml乙酸乙溶解,离心,检测上清中利血平含量,计算收率酯溶解后,再加5ml甲醇,4℃放置20h,离心,2.4.2溶解生物碱取5份利血平粗提液,每份得粗结晶。粗结晶加入过量丙酮直至溶解,浓20ml,分别在50℃真空浓缩至约7ml,各加2倍缩至约9ml,加18ml甲醇,4℃放置20h。离水,用浓NaOH调至pH8.5,离心。沉淀分别加心,得重结晶。所得晶体放入40℃烘箱中烘10ml不同比例的丙酮一氯仿溶解,离心,检测上1.75h,称重。记录每一步的收率,然后计算其清中利血平含量,计算收率。总收率。2.4.3沉淀胶质取40ml溶解生物碱沉淀的丙酮一氯仿混合溶液,减压蒸去有机溶剂,弃去3结果剩余的水相后,沉淀加8ml丙酮溶解,分成4等3.1催吐萝芙木根粉中利血平含量的测定份,分别加不同体积的石油醚一氯仿(1:1),振中国煤化工粉中利血平的含量摇1h沉淀胶质离心。分别用1ml石油醚洗涤为oCNMHG胶质沉淀,离心。合并两次上清液,检测上清中3.2利血平的结晶工艺利血平含量。将胶质取出,放在表面皿上晾干,3.2.1沉淀生物碱称重。3.2.1.1加水量的选择实验结果见表1。112药物生物技术第14卷第2期Tab 1 Effect of amount of added water on yield3.2.1.2pH值的选择实验结果见表2of precipitated reserpineTab 2 Effect of ph value on yield of precipitated reserpineRatio of added water0:11:12:13:14:1pH value607.08.09.0and raw extract(v/v)Yied(%)92.297.799.898.3100.6Yield (%)73.2 90.9 97. 3 94.6 98.7 Note, yield (%)=(reserpine amount in acetone solution + reser-Notel: yield(%)=(reserpine amount in acetone solution+repine amount in chloroform solution)/ reserpine amount in raw ex-serpine amount in chloroform solution)/ reserpine amount in rawtract×100%extract%从表2可见,随着pH值逐渐增大,利血平收不加水和加1倍体积的水,调pH值8.0沉淀率增加,当pH8~10时,达到较高的收率。但利生物碱后离心,所得上清比较混浊说明沉淀物较血平在强碱条件下不稳定,容易水解,所以选择难沉降,收率较低。从表1可见,当加水量为2倍pH8.0~9.0范围内沉淀生物碱。体积或更大时,沉淀较为完全。加2倍水的收率就32.2溶解生物碱实验用丙酮氯仿配制混合达到973%,与3、4倍水的收率相差不多,但用水溶剂,改变两者的比例考察溶解利血平的收率结量小,所以选择2倍水。果见表3。Tab 3 Effect of proportion of acetone and chloroform on yield of dissolvedRatio of acetone and chloroform1:1nout chloroform)Yield(%)88.096.393.6Note: yield(%)= reserpine amount in acetone-chloroform solution /reserpine amount in raw extract 100%从表3可见,只使用丙酮,利血平收率较低;丙酮氯仿混合溶剂中,其中含有少量的水,还含有酮氯仿比例为5:1和9:1的时候,利血平收率相当多的胶质,会影响以后的结晶,需要除去。较高;但氯仿加得太多时,胶质类杂质会变成粘稠石油醚对胶质的溶解度很小,可以用来沉淀胶状,使沉淀结块,收率降低。所以选择丙酮一氯仿质但石油醚对利血平的溶解度也很小,沉淀胶质(9:1)溶解生物碱沉淀,用量为利血平粗提液体积时利血平的损失较大,因此选择石油醚氯仿(1的50%1)作为沉淀剂。实验结果见表43.2.3沉淀胶质包括利血平的生物碱溶解在丙Tab 4 Effect of amount of petroleum ether-chloroform on precipitating gumAcetone-petroleum Acetone- petroleumAcetone-petroleumAcetone- petroleumAdded solventether-chloroformether-chloroformether-chloroformether-chloroform(4:1:1)(4:2:2)(4:3:3)(4:4:4)Reserpine amount in66.366.762.5supernatant(mg)Gum amount by388.6371.265.8354.2precipitation(mg)从表4可见,丙酮石油醚一氯仿的比例为3.2.4粗结晶4:2:2时,上清中利血平含量最高沉淀的胶质3.2中国煤化工的粗结晶可选用溶的量与丙酮石油醚一氯仿(4:1:1)相差不大。解度CNMH配成的混合溶剂。所以选择丙酮石油醚氯仿(4:2:2)为沉淀乙酸乙酯丙酮可作为溶解度大的溶剂,这是因为它剂且石油醚、氯仿的总量为利血平粗提液的10%们对利血平的溶解度较大,对未除尽的胶质溶解度左右。也较大易于将包裹在胶质中的利血平溶解。而甲孙蕾等:利血平结晶工艺的研究113醇、乙醇可作为溶解度小的溶剂。实验结果见表5。3.2.5重结品重结晶选用丙酮和甲醇组成的混从表5中看出,乙酸乙酯的结晶效果高于丙合溶剂。实验结果见表7。酮,甲醇的结晶效果高于乙醇,因此选用乙酸乙从表7可见,随着甲醇用量的增加,收率明显酯一甲醇作为结晶混合溶剂。增加,但纯度有所下降。丙酮一甲醇体积比为13.2.4.2甲醇用量的选择实验结果见表6。1和1:2时,纯度相差不多,且后者所得晶体量较从表6可见,当甲醇用量大于乙酸乙酯的2倍多,所以选择丙酮甲醇(1:2)。时,所得晶体总量较多,所以确定结晶溶剂为乙酸3.3小试工艺验证乙酯一甲醇(1:2.5)。小试工艺提取利血平的收率见表8。Tab 5 Effect of different solvents on reserpine crystallizationolvent of crystallization Ethyl acetate-methanol Ethyl acetate-ethanol Acetone- methanol Acetone-ethanolCrystallized reserpine (mg)17.38.516.54.6Tab 6 Effect of methanol amount on reserpine crystallizatiTab 7 Effect of methanol amount on reserpine recrystallizationRatio of acetone andRatio of ethyl acetate1:11:21:31:4l:11:21:3and methanolRecrystallized reserpine(mg) 65.0 72.4 77.6Purity(%)98.398.297.9Crystallized reserpine (mg) 57.8 62.6 64.3 63. 8Note! purity(%)= Area of reserpine peak in hPLC/ total areaof all peaks in HPLCX 100%Tab 8 Yield of extracted reserpine in small trailProcedureOperationYield in this step(%)Total yield(%)2123Concentration of extractFiltration before adsorption by resin96.5Concentration by macroporous resin83.6Precipitation and dissolution of alkaloids82.5Precipitation of gum86.86Crystallization72.Recrystallization68.6Note!: Yield in this step(%)= reserpine amount in this step/reserpine amount in preceding stepX100%Note?: Total yield(%)=reserpine amount in this step/reserpine amount in extract X100%小试所得利血平晶体的总量为0.7129g,纯29.8%从催吐萝芙木用量计算总收率为度达98.4%,从酸性乙醇提取液计算总收率为0.285‰。利血平晶体的高压液相图谱见图1。mAUreserpine中国煤化工CNMHGA: Reserpine standardB: Reserpine crystalFig 1 hPlc of reserpine standard and reserpine crystal114药物生物技术第14卷第2期利血平的提取总收率仅为29.8%,原因是提4讨论取、结晶的步骤较多,利血平相应的损失也较大。用含乙醇的酸性水从催吐萝芙木中提取利血步骤14的损失与浓缩时温度较高有关,因此要严平时,容易将催吐萝芙木中的胶质一并提取出来。格控制浓缩温度以减少利血平的破坏。步骤5沉虽经大孔树脂提纯,也难以去除胶质。大孔树脂提淀胶质时,胶质中会夹带部分利血平一起沉淀,造取液浓缩后加水,再调节pH为碱性,沉淀生物碱,成损失,应该充分搅拌以提高收率。步骤6、7结晶胶质也随之沉淀出来。本文选用丙酮溶解生物碱和重结晶的损失最大,这是由于母液中含有较高浓沉淀,是因为在丙酮中胶质易于分散,从而可以将度的利血平,而小试是单批实验,无法回收。在规大部分利血平溶解。但丙酮对利血平的溶解度不模放大的多批实验中,可以将本批实验的结晶母液够大,还需用氯仿再溶解一次。氯仿对利血平的溶和重结晶母液加在下一批的沉淀胶质步骤中,回收解度很大,缺点是会使胶质聚集成团,致使利血平其中的利血平。此外,整个实验过程中应注意避包裹在胶质内部,不易溶解出来,所以氯仿用量不光,以降低利血平见光分解的损失能太大。参考文献在小试工艺验证实验中,用丙酮一氯仿(9:1)溶液溶解生物碱沉淀时,因为沉淀的生物碱量较1]周丽娜戴斌,丘翠嫦萝芙木质量标准修订的研究[J广西多,需用较多的丙酮一氯仿溶液,用量超过了粗提中医药,2003,26(5):37.液体积的一半。随后的步骤中加入丙酮溶解沉淀,〖2]田学军龙云惠何英等绿春萝英木资源薄层色谱鉴别J].红河学院学报,2005,3(6):23再加入氯仿一石油醚(1:1)沉淀胶质,由于小试中[3]张志信,张仕秀,宋关斌D51大孔树脂酸水法提取利血处理的样品量比做结晶条件实验时要大,所用的溶平的工艺研究[J].药物生物技术,2004,11(3):157.解固体的溶剂可以相应减少。本步骤所用的丙酮4]柯铭清中草药有效成分理化与药理特性[M第2版长沙:为粗提液的5%,氯仿一石油醚用量也为粗提液湖南科学技术出版社,1982,196.的5%。Study on Crystallization of RespersineSUN Lei, FENG Lei, ZHOU Ye, QIAN Xiu-ping, ZHAO Feng-sheng(Scholl of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)Abstract Crystallization process of reserpine was investigated in this paper After separation from rauuolfia vomitoria through the process of rough extraction, precipitation of alkaloids, dissolution of pre-cipitation, sedimentation of gum, crystallization and recrystallization, reserpine was obtained. Variousfactors affecting the isolation of reserpine were studied by single factor method. Suitable conditions forthe crystallization of reserpine were optimized. The purity of reserpine was 98. 4%. Total recovery yieldwas 29.8%. The crystallization technology can bring about high purity and recovery of reserpine. It isapplicable for industrial production.Key words Rauvol fia vomitoria, Reserpine, Crystallization信息2007-10一种低聚糖一新科斯糖的发酵法生产方法新科斯糖中国煤化工勺葡萄糖基6碳位相连接构成的蔗果三糖,与普通低聚果糖相比,它又具有更为优越的增殖CNMHG夫酵母28为出发菌株,发酵生产新科斯糖的方法和工艺条件,包括发酵的培养基组成、浓度、温度、pH培养时间等。控制一定的发酵条件可得到较高产量的新科斯糖