海藻酸锰固定化细胞的乙醇发酵

第27卷第4期南京林业大学学报(然科学版)( A Journal of Nanjing Forestry University( Natural Sciences Edition) Jul, 2003海藻酸锰固定化细胞的乙醇发酵宋向阳1,徐勇,杨富国2,勇强,余世袁(1.南京林业大学,江苏南京210037;2.中南大学,湖南长汐410083)攏要:以树千毕赤酵母( Pichia stipitis为发酵茵株,利用海藻酸鈺凝胶代替海藻酸钙·固定化酵母使用寿命明罡增加。釆用混合糖60gL(50%菊萄糖、50%木糖)为发酵底物,以250mL三角瓶为反应器,在35℃、150r/min、pH5.0条件下,嵊荡发酵。结果表明,海藻酸锰树干毕赤园定化增殖酵母细胞能使戊糖和己糖同步发酵,海藻酸锰凝胶耐磷酸盐能力是海藻酸钙凝胶的3倍,海藻酸锰固定化树干毕赤酵母细胞乙醇发酵42d,固定化细胞稳定,总糖利用率为95.8%,乙醇得率为理论得率的92.3%,发酵稳定时间明昰长于海藻酸钙圊定化酵母細胞乙醇发酵的稳定时间(24d)。关键词:树干毕赤酵母;海藻酸锰;固定化细胞;糖;乙醇中图分类号;Q53文献标识码:A文章编号:1000-2006(2003)04-0001-04Fermentation of Ethanol by Immobilized Cells of Manganese AlginateSONG Xiang-yang, XU Yong, YANG Fu-guo', YONG Qiang', YU Shi-yuan'(1. Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 2. Central SouthUniversity, Changsha 410083, China)Abstract: The life time of immobilized Pichia stipitis yeast cells was prolonged greatly when the gelwas formed with manganese alginate compared to that with calcium alginate. The ability of enduringphosphate of manganese alginate gel was increased 3 times than that of calcium alginate gel Fermentation of glucose- xylose mixture to ethanol was investigated in 250 mL shake-flask at 35C, pH 5. 0 and150/min Glucose-xylose mixture could be co-fermented to ethanol by immobilized Pichia stipitisyeast cells of manganese alginate. The results showed that immobilized cells of manganese alginate gelwere still definite when fermentation of ethanol lasted 42 d, and utilization ratio of total sugar was95, 8%, yield of ethanol rcached 92.3% of theoretical, While fermentation of ethanol by immobilizedPichia stipitis yeast cells of aluminum alginate only lasted 24 d. It provided the basis of theory for preucing ethanol witKey words: Pichia stipitis Manganese alginate; Immobilized cells; Xylose; Ethanol固定化细胞技术根据固定化方法大致分为吸附法、包埋法、共价法和交联法,其中以包埋法应用最为普遍。载体是國定化细胞技术的核心部分。包埋法中的载体有多种,如聚丙烯酰胺凝胶、海藻酸钙、角叉菜聚糖、琼脂糖、明胶等。目前固定化细胞技术已成为国际上研究的热点之一~4,广泛应用于工业、医学、环境保护、能源开发及化学分析等诸多领域。海藻酸钙是迄今应用最为广泛的一种固定化载体。它具有网格孔隙大、传质阻力小制备方法简单及价格低廉等优点。但其强度较差,使用寿命短。这主要是由于培养基中的磷酸盐逐渐使海藻酸钙凝收稿日期:2002-04-25修回日期:2003-0103基金项目:国家自然科学基金资助项目(39970597)作者简介:宋向阳(1965-),男,江苏无锅人,南京林业大学化学工程学院测教授博士,南京林业大学学报(自然科学版)第27卷第4期胶破裂和解体。延长海藻酸钙凝胶使用寿命的处理方法较多。笔者利用Mn对Ca¨置换法,将低浓度的树于毕赤酵母( Pichia sti pitis)细胞固定,通过增殖培养,能高效地同步发酵戊糖和已糖,形成的海藻酸锰固定化酵母细胞耐磷酸盐能力显著增强,其使用寿命显著增加。为固定化细胞乙醇发酵的工业化生产提供理论依据材料与方法1.1菌种和培养基菌种为树干毕赤酵母( Pichia stipitis),由南京林业大学生物化工研究所保藏,该菌种能够同步发酵戊糖和己糖酵母细胞培养基为木糖20.0g/L,蛋白胨5.0g/1-,酵母汁3.0g/L,培养基pH5.0;固定化增殖培养基为葡萄糖30.0g/L,木糖30.0g/L,蛋白胨3.0g/L,酵母汁2.5gL,CaCl2.5g/L,MgS(,0.25g/I,KHPO2.5g/I,培养基pH5.0;发酵培养基为葡萄糖30.0g/L,木糖30.0g/L,CaCl22.5g/L,MgSO40.25g/L,KH2PO42.5g/l,培养基pH51.2固定化细胞的制备与增殖将试管斜面菌种接入液体酵母细胞培养基,在30℃、150r/min条件下活化2d,取2mL菌液与3%海藻酸钠溶液(68mL.)于常温下混合,注人2%CaCl2水溶液中,固化4h,用无菌水将固化后的海藻酸钙凝胶球(直径2~3mm)洗3次(每次50mL),移入1.2%MnSO4溶液中,放置冰箱(4℃)固化24h。将固定化好的凝胶球(直经约3mm)置于增殖培养基中,在30℃、150r/min条件下增殖培养12h更换一次新鲜培养液,共增殖4次L.3乙醇发酵将固定化凝胶球川无菌水洗3次后,移人发酵培养基中。发酵容器为250mL三角瓶,发酵液体积与凝胶球的堆积体积之比为3:2,其中发酵液体积为50m1,总体积为80mL。将三角瓶置于恒温振荡器中,在35℃、150r/min条件下进行乙醇发酵。利用固定化细胞重复式发酵,每一批发酵结束后,收集发酵液,接人新鲜发酵液1.4分析测定当一批发酵结束后,倾去发酵液,称取三角瓶与固定化细胞质量减去空三角瓶质量,即为固定化细凝胶颗粒湿重。利用高效液相色谱法测定乙醇含量。釆用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖。2结果与分析2.1固定化凝胶颗粒耐磷酸盐能力海藻酸钙是一种应用较为广泛的固定化载体,但其强度较差,使用寿命短。在制备海藻酸钙凝胶颗粒过程中添加活性炭、Al2O3、SiO2、MnCl2等,尽管表1固定化细胞凝胶颗粒耐磷酸盐能力可不同程度地增加海藻酸钙的机械强度及稳定性, Table 1 Test of enduring phosphate of gel bends但由于发酵培养基中的磷酸盐逐渐使海藻酸钙凝胶on cells immobilization颗粒破裂和解体,所以海藻酸钙凝胶使用寿命提高实验添加物添加物质凝胶颗粒溶凝胶颗粒破并不明显。试验通过Mn2+对Ca2-置换法,形成的量分数%解时问/mn裂时间/min1A2O3(A)海藻酸锰固定化酵母细胞耐磷酸盐能力明显增强。2A:O3(B试验过程为:分别称取1g固定化凝胶颗粒,溶于MteA)50m浓度为0.1mol/l的磷酸盐中性缓冲液中,5 St(A)于35℃条件下,间歇振荡,确定固定化凝胶颗粒开65(B裂及溶解的时间,以测试凝胶颗粒耐磷酸盐能力活性炭结果见表1。8活性炭(B)9空H从表1可见海藻酸钙凝胶颗粒中添加剂不同,19A:(S0,(B)1.0其耐磷酸盐能力也不同。添加活性炭的固定化凝胶Mn90(B.034030颗粒耐磷酸盐能力没有明显提高,由于活性炭表面注:A表示添加物在灭)前加入B表示添加物在灭菌后加入。203年总第106期宋向阳等:海藻酸锰固定化细胞的乙醇发酵积比较大且具有多孔性,添加到海藻酸钙凝胶颗粒屮,增加了固定化细胞的通透性,但其耐磷酸盐能力提高不多,开裂时间为30min,比空白(不添加物的)多10min,溶解时间均为120min。添加SiOh比№O)效果要好,耐磷酸盐能力提高2倍,这是由于SO2为原子型晶体,强度较高,添加至凝胶颗粒中可增加其强度。而采用冒换法形成海藻酸锰、海藻酸铝的固定化细胞耐磷酸盐能力增强显著,因为Mn3、∧}'把(aξ-从海藻酸钙凝胶颗粒中置换岀来,磷酸盐对海藻酸锰、海藻酸铝的凝胶顆粒破坏性减少,故海藻酸锰、海藻酸铝的固定化细胞耐磷酸盐能力提高3倍2.2MnSO4溶液浓度对固定化细胞乙醇发酵的影响配置0,4%,0.6%,0.8%,1.0%,1.2%,1,4%,981.6%的MnSO)溶液,利用Mn对Ca2置换法,分9别制备成海藻胶锰固定化酵母细胞,通过增殖培养,使凝胶株表面的树十毕赤酵母细胞密集,形成高浓度的固定化酵母细胞、高效地利用皮糖,已糖同步发酵成乙醇。MnSO4溶液浓度对固定化细胞乙醇0.40.60.81.01.21.41.6发酵糖利用率的影响见图1。MnS04溶液质量分数由图1可见,MnO溶液浓度对固定化酵母细图1MnsO,溶液质量分数对固定化细胞乙醇胞乙醇发酵的影响较大。当MnSO4溶液质量分数为发酵糖利用率的影响0.4%~1.2%时,随着Mn2浓度的增加,还原糖利Fg.1 Effects of concentration of Mnso) solution on用率逐渐升高。如MnSO4溶液质量分数为0.4%utilization ratio of sugar of ethanol fermentation0.6%,0.8%,1.0%时,还原糖利用率分别为by cells immobilization91.7%,92.8%,93.6%,94.6%,当MnSO4溶液质量分数为1.2%时,还原糖利用率达最大值95.8%。而当MnSO溶液质量分数超过1.2%时,随着Mn2+浓度的增加,还原糖利用率反而下降。即MnSO)溶液质量分数1.2%为转折点。这是因为Mn2浓度对海藻酸钙的置换影响较大。当MnSO4溶液质量分数为0.4%由于Mn2+浓度低,海藻酸根螯合及置换出海藻酸钙中的Ca2+形成的海藻酸锰凝胶的作用较弱凝胶株强度差,稳定性低。显微镜下观察,醪液屮溢出的游离细胞较多,还原糖利用率为91.7%当 EnSO,溶液质量分数超过1.2%时,虽然凝胶株的机械强度有所提高,醪液中游离细胞减少,但是凝胶株弹性变小,且凝胶株介质表面过于稠密,降低了底物及营养盐通过酵母细胞的传质能力,故还原糖利用率下降。结果表明,当MnSO4溶液质量分数为1.2%时,形成的海藻酸锰固定化酵母进行乙醇发酵最佳2.3发酵液pH对固定化细胞乙醇发酵的影响将海藻酸锰固定化增殖酵母凝胶颗粒各30m表2发酵液pH对海藻酸锰固定化细胞分别放入体积为50ml不同pH混合糖(混合糖浓醇发酵24h的影响度为60g/1,木糖和葡萄糖各占50%)的发酵液中,Tae2 Effects of pH value of the broth on ethanol在35℃,150r/min条件下,发酵24h,结果见表2。fermentation for lasting 24 h by cells从表2可见,发酵液pH在3.0~6.0范围内immobilization of manganese alginate发酵液pH越低,越不利于海藻酸锰固定化酵母细PH浓度(,1用幸%细胞重理论得胞的生长和繁殖。当发酵液pH3.5时,残糖浓度3.028.5152.442.30.216高达16.72g/L,乙醇得率为理论得率的32.1%。3.516.7272.118.50.32显做镜下观察酵母细胞部分形态已不圆滑,单细胞02.6197570,896较多,芽孢少,即酵母细胞长时间在pH3.5以下发.52.530.B23生变形,其生物功能降低或丧失,糖代谢能力下降,6.02.2359.30.925己醇得率显著降低。当发酵液pH为4.0时酵母细胞形态圆滑糖利用率高,残糖仅3.93g/L,乙醇得率为理论得率的896%。发酵液pH5.5时,乙醇得率为理论得率的923%。发酵液pH大于5.5时,乙醇得率虽有提高,但工业生产时高pH发酵液易染菌。因此,当pH为5.0~5.5时海藻酸锰固定化细胞乙醇发酵较适宜,此结果与海藻酸钙固定化酵母乙醇发酵最适宜pH相吻合南京林业大学学报(自然科学版)第27卷第:期2.4海藻酸钙、海蘰酸铝及海藻酸锰的乙醇发酵利用海藻酸钙、海藻酸铝和海藻酸猛的固定化7增殖树干毕赤酵母细胞,在35℃、150r/min条件下对浓度为60g/1.混合糖(50%葡萄糖、50%木糖)分三別进行发酵试验(图2)。结果表明,3种固定化增殖墼树干毕赤醇母细胞前24d乙醇发酵均较稳定,但要3:三=本24d以后差异明显发酵至36d,海藻酸钙固定化细胞乙醇发酵中,6122428364248残糖浓度由2.87g/I.(24d)上升至3.53g/L,其固发醇周期/d定化细胞重量由59.4g下降至53.6g,减少5.8g;图2海藻酸钙、海藻酸铝、海藻酸锰而海藻酸锰固定化细胞乙醇发酵稳定,固定化酵母固定化细胞的乙醇发牌细胞流失少,仅减少2.6g。即海藻酸钙、海藻酸铝和Fi;.2 Ethanol fermentation of inurmolilizcd cells of calcium海藻酸锰的固定化酵母细胞乙醇发酵可分别稳定发alginate, aluminum alginate and manganese alginate酵24、36及42d。这是因为发酵培养基中磷酸盐逐海藥酸钙固定化细胞乙醇发酵残糖浓度:O海漸使海藻酸钙凝胶破裂,而海藻酸铝、海藻酸锰的固酸锰定化细眶乙醇发酵残巒浓度;·海酸定化细胞耐磷酸盐能力明显强于海藻酸钙固定化细定化细胞乙牌发酵残櫆浓度;▲一海藻酸钙固定化胞凝胶联粒重海藻酸铝固定化细胞凝胶颗草重胞。海藻酸锰圊定化酵母细胞乙醇发酵稳定性长于。—海落酸误因定化组胞凝胶颗粒重海藻酸铝的固定化酵母细胞,因为海藻酸锰凝胶颗粒强度虽然略差于海藻酸铝固定化细胞,但海藻酸锰凝胶颗籼富有弹性,细胞固定得牢固,凝胶颗粒不容易破碎。海藻酸铝固定化细胞凝胶颗粒强度较大,但凝胶颗粒比海藻酸锰固定化细胞凝胶颗粒脆性大,容易产生裂痕,最终导致细胞流失及凝胶颗粒自溶。所以,海藻酸锰固定化细胞乙醇发酵要比海濚酸铝固定化细胞乙醇发酵稳定时间长6d。3结论(1)Mn3-对Ca°+置换形成的海藻酸锰固定化酵母细胞耐磷酸盐能力明显增强,而MnS()溶液浓度对固定化酵母细胞乙醇发酵糖利用率的影响较大。以不同质量分数MnSO溶液分别制成的海藻酸锰固定化细胞进行乙醇发酵,当MnSO.溶液质量分数为1.2%时,海藻酸锰固定化酵母乙醇发酵的糖利用率最高,达95.8%。(2)耐磷酸盐能力试验表明海藻酸钠溶液中添加SO效果较好,形成的海藻酸钙固定化细胞耐磷酸盐能力是不添加的2倍。而以置换法形成的固定化酵母细胞要比以添加法形成的好,形成的海藻酸锰固定化酵母细胞耐磷酸盐能力是不添加SiO3的3倍。3)采用置换法形成海藻酸锰固定化细胞,其发酵稳定性由24d延长至42d,乙醇得率为理论得率的92.3%[1张树政酶制剂工业:上[M].北京:科学技术出版社,1998:350.[2i Lata A, Garria L A Dazm. Analysis anr description of the evolution of alginate immobilized cells systems[J] Journal of liotechnols3]Massinmtilano F. Federico F, Laura S, t al Repeated-batch production of pigments by immobilized Monascus purpureus,.. Journal ofBiotechnology. 2000. 80: 271-276.LiJ Mahesh S K, Maria B, Christopher K S,et al. Ethanol production from glucose and xylase by immobilized Z ynomonu s munitis CPIApplied Biotechmistry and Biotechnology, 2000.84-86:525-5415]严复,曲立民,金夙燮,等.高联海藻酸钙固定化酵母的制备及其化学稳定性的研究[]牛物工释学报,1985,11):81-81[]田小光,海藻酸铝固定化酵母生产高浓度酒精的研究[门]生物学通报,1995,22(5):282-284.(责任编李燕文)