深入了解融合基因，引物设计及载体构建案例详解！

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融合基因引物设计—根据参考文献设计引物

PMID：19293179，IF：9.13，Cancer Res. 2009 Apr 01;69(7)

PMID：19293179，IF：9.13，Cancer Res. 2009 Apr 01;69(7)

PMID：19293179，IF：9.13，Cancer Res. 2009 Apr 01;69(7)

融合基因引物设计—根据目的蛋白序列设计引物

以结核分枝杆菌TB10.4-Hsp16.3为例，需设计两对，四条引物，P1:TB10.4上游引物，P2:TB10.4下游重叠引物，P3：Hsp16.3上游重叠引物，P4:Hsp16.3下游引物

重叠PCR技术：

重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。

此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理。

引物设计与合成：                                         

根据Genbank报道的Mtb H37Rv株TB10.4和Hsp16.3基因序列设计如下引物：TB10.4上游引物(P1)：GGATCC ATGTCGCAAATCATGTACAACT，TB10.4下游重叠引物 (P2)：GCTTCCACCGCCACC GCCGCCCCATTTG；Hsp16.3上游重叠引物 (P3)：GGTGGCGGTGGAAGC ATGGCCACCACC，Hsp16.3下游引物(P4)：AAGCTT TCAGTTGGTGGACCGGATC。P1含BamH I 酶切位点，P2、P3含互补的接头序列，P4含Hind III酶切位点。

融合基因PCR：

步骤一：扩增TB10.4及Hsp16.3以Mtb H37Rv基因组DNA为模板，分别以P1和P2、P3和P4为引物对，扩增TB10.4和Hsp16.3基因片段。

扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；72℃终止5 min。回收纯化TB10.4和Hsp16.3。

以重叠延伸PCR技术将两者连接，此时扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸45s，共10个循环；

72℃终止5 min；再加入引物P1、P4，扩增融合基因TB10.4-Hsp16.3，此时扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共32个循环；72℃终止5min。

融合基因实验结果图：

琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物

图一：

第一泳道：约300bp的TB10.4

第三泳道：约450bp的Hsp16.3

图二：

第一泳道：约750b的TB10.4-Hsp16.3

融合基因实验结果图：

DNA测序鉴定

部分测序结果，将测序结果与GeneBank中基因序列相比。以验证融合基因序列正确性。

融合因载体构建

载体名称：pET-28a（+）

酶切位点：BamH I 、Hind III酶切

载体抗性：Kan（卡那霉素）

实验步骤：

1、碱裂解法提取质粒DNA

2、pMD-TB10.4-Hsp16.3和pET-28a(+)质粒双酶切

3、纯化双酶切的融合基因TB10.4-Hsp16.3和表达载体pET-28a(+)

4、取酶切的TB10.4-Hsp16.3 与pET-28a(+) 连接

5、转化进E.coli DH5ɑ的感受态细胞

第一泳道：菌落PCR鉴定TB10.4-Hsp16.3

第二泳道：双酶切后TB10.4-Hsp16.3及pET-28a(+）

第三泳道：未酶切pET-28a(+）

融合基因表达：

重组融合蛋白TB10.4-Hsp16.3的纯化

实验步骤：

1、制备E.coli BL21(DE3)感受态细胞

2、将重组质粒转化进感受态细胞

3、抗性筛选

4、挑取单菌落振荡培养

5、IPTG诱导

6、SDS-PAGE分析

第一泳道：表达产物超声后上清

第二泳道：表达产物超声后沉淀

第三、四、五泳道：纯化TB10.4-Hsp16.3（29kd）

融合基因免疫活性分析：

实验步骤：

将纯化的TB10.4-Hsp16.3进行12%SDS-PAGE分离；150mA恒流转印2h，转印后的NC膜用5%脱脂奶粉于4℃封闭过夜；分别加1：100稀释的TB患者阳性混合血清和健康体检者混合血清，37℃作用2h，PBST洗膜5次；加1：3000稀释的HRP标记羊抗人IgG，37℃作用2h，PBST洗膜6次；以增强型ECL化学发光检测结果。

融合基因抗体制备：

融合基因抗体制备实验步骤：

1、利用原核表达载体体外细菌大量表达融合蛋白，并利用Ni+-NTA柱纯化蛋白，Western-blot法鉴定后Balb／c小鼠体内注射免疫小鼠。

2、免疫后的小鼠脾脏在无菌条件下破碎，将B细胞悬浮在没有血清的培养液中，并洗涤3次去掉小鼠的血清。

SP2／0细胞是用加有10％胎牛或小牛血清培养的，每天更换新鲜培养液使成为对数分裂期生长旺盛的细胞。

细胞用RPMIl640洗涤2—3次，把两种细胞合并在同一试管中，用50％的聚乙二醇(相对分子质量为1000—1500)作为融合剂，在37℃条件下融合l-2min。然后用1640培养液缓慢稀释，然后除去PEG，将细胞分散至HAT选择培养板中。

3、阳性杂交瘤细胞的筛选与单克隆化：杂交细胞经约10-14d培养后，形成可用的细胞集落(克隆)。经过几次更换培养液(HT培养液)后进行抗体活性检测。产生特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株即扩大培养，以获得足够的细胞用于保存和制备可供应用的抗体。

4、抗体需纯化及western blot法鉴定。

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